本发明涉及一种微藻培养方法，所述方法将微藻固定化培养和液体培养相结合，具体是将微藻接种到固体材料上进行固定化培养，然后将经过固定化培养的微藻接种到液体中继续培养。使用本发明的方法培养微藻不需要严苛的条件，能耗较低，不易发生污染，并且能够产生高密度的藻细胞，能够通过固-液培养结合的方法实现色素、脂类、烃类和糖类等次生代谢物的产业规模化生产。
1.一种微藻培养方法，其特征在于，将微藻固定化培养和液体培养相结合。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将微藻接种到固体材料上进行固定化培养，然后将经过固定化培养的微藻接种到液体中继续培养。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，微藻固定化培养后进行采收步骤，采收时的微藻密度为20g-200g/m²。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，将微藻接种到所述固体材料的初始接种密度为5-50g/m²。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述固体材料表面的光照强度为10-600μmol/m²/s。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述固定化培养时通入含二氧化碳的气体，所述二氧化碳占所述气体的体积百分比为0.1-15%；优选地，培养的温度为15-50℃。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述液体是各种类型、浓度或成分的微藻培养基，含一种或多种微藻的藻液，水，含促进因子的溶液，含胁迫诱导因子的溶液中的一种或几种。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述微藻包括蓝藻门、绿藻门、黄藻门、异鞭藻门和红藻门的微藻。
9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，将固定化培养的微藻接种到液体的初始接种密度为0.5-20g/L。
10.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述液体培养时培养物表面的光照强度为100-2500μmol/m²/s。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其特征在于，在所述液体培养时调整光照强度、温度、液体成分和浓度、二氧化碳的浓度和pH值各项参数中的一项或多项进行诱导培养产生次生代谢物。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述诱导培养的时间为2-10天，优选3-4天。技术领域
本发明涉及微藻培养技术领域，具体涉及一种微藻培养方法。
背景技术
微藻是具有叶绿素、能进行放氧的光合作用的低等水生生物，其结构简单，生长繁殖迅速，对太阳能利用率高，对环境适应性强，因此受到人们越来越多的重视。微藻所含有的活性物质和生产的次生代谢物具有重要的经济价值，在能源领域，微藻有望成为继粮食作物生物乙醇、纤维素生物乙醇和陆生作物生物柴油之后的第三代生物质能源原料；在环境领域，微藻具有减排温室气体二氧化碳的能力，并在处理生活和工业污水方面有广阔的应用前景；在食品领域，微藻富含蛋白质、油脂、类胡萝卜素和不饱和脂肪酸，可用于食品或食品添加剂；在医药领域，从微藻生物资源中寻中新的抗生素、抗癌和抗病毒药物的研究也常见报道。某些微藻在特定的生长条件下能够大量合成次生代谢物如油脂、多糖或类胡萝卜素等，而次生代谢物的积累是可控的过程，这些特点加快了微藻实现各种次生代谢物的商业化开发。我们可利用环境条件的改变和养殖工艺升级改造，实现微藻次生代谢物的高效积累。目前对微藻生产次生代谢物养殖多采用的是液体培养，先严格控制其pH值、温度和营养条件，使其在最适条件下产生尽量多的营养细胞，然后再利用胁迫条件诱导营养细胞产生次生代谢物。雨生红球藻的养殖国外多采用该法，美国夏威夷的公司则是采用封闭的光生物反应器结合开放式的培养池进行液体养殖；杜氏盐藻生产类胡萝卜素也多采用该法，在绿色藻细胞生物量积累到一定程度后，转移到高盐高光环境下，诱导藻细胞β-胡萝卜素积累。在传统的微藻液体养殖中，大量的能量消耗在水体运行、搅拌、通气、二氧化碳补给和收获上，而藻细胞密度并不高(约1-3g/L)；需要条件苛刻，必须严格控制环境条件，中间有环节出现问题，可能导致细胞增殖的失败；若水体中一旦发生原生动物或杂藻污染，治理较难或无法治理，只能废弃，从而产生大量的物力和人力成本。总之，现有技术存在条件苛刻、能耗高、易污染和细胞密度低的问题。
发明内容
本发明针对传统的微藻液体养殖中条件苛刻、能耗高、易污染和细胞密度低的问题，提供一种微藻培养方法，使用本发明的方法培养微藻不需要严苛的条件，能耗较低，不易发生污染，并且能够产生高密度的藻细胞。本发明的技术方案如下：一种微藻培养方法，是将微藻固定化培养和液体培养相结合。具体可以是，将微藻接种到固体材料上进行固定化培养，然后将经过固定化培养的微藻接种到液体中继续培养。本发明的微藻培养方法中，固体材料是具有亲水性和/或保水性的固体材料，例如无纺布、醋酸纤维膜、粗布、海绵、筛绢和棉布条中的一种或多种，或其它任何能够粘附微藻的固体材料。所述固体材料的形状可以是平面状、立方体状、球状或线条状等。本发明的微藻培养方法中，固体材料可以仅仅是上述材料中的任何一种，也可以两种以上组合使用，典型但非限定性的组合实例比如醋酸纤维膜和无纺布组合，醋酸纤维膜和粗布组合，海绵和筛绢组合，无纺布和棉布条组合，等等。本发明的微藻培养方法中，固体材料具有亲水性和/或保水性，能够很好地保持液体培养基，为微藻提供生长需要的营养成分；同时，固体材料还提供微藻生长的支持介质。由于采用固定化培养，不涉及液体培养中的搅拌和水体运行等，因此能耗较低，并且降低了外源性污染的风险。本发明的微藻培养方法中，培养基可以是能够用于微藻培养的任何培养基，本领域的技术人员可以根据具体每一种微藻适用的培养基进行选择。虽然如此，本发明实施例中所用培养基为BG11培养基。BG11培养基的具体配方如表1所示：表1BG11培养基的配方成分
含量
NaNO₃
1.5g/L
K₂HPO₄·3H₂O
0.04g/L
MgSO₄·7H₂O
0.075g/L
CaCl₂·2H₂O
0.036g/L
柠檬酸
0.006g/L
FeCl₃·6H₂O
0.00315g/L
Na₂EDTA·2H₂O
0.00436g/L
Na₂CO₃
0.02g/L
A₅微量元素*
1ml/L
其中，A₅微量元素的配方如表2所示：表2A₅微量元素的配方成分
含量
H₃BO₃
2.86g
MnCl₂·H₂O
1.81g
ZnSO₄·7H₂O
0.222g
CuSO₄·5H₂O
0.079g
Na₂MoO₄·2H₂O
0.390g
Co(NO₃)₂·6H₂O
0.0494g
去离子水
1L
本发明的微藻培养方法中，微藻固定化培养后进行采收步骤，采收时的微藻密度为20g-200g/m²，例如25g/m²、30g/m²、50g/m²、100g/m²、180g/m²或190g/m²。本发明的微藻培养方法中，将微藻接种到所述固体材料的初始接种密度可以是5-50g/m²，例如10g/m²、15g/m²、20g/m²、25g/m²、30g/m²、35g/m²、45g/m²、45g/m²、48g/m²或50g/m²。本发明的微藻培养方法中，所述固体材料表面的光照强度可以是10-600μmol/m²/s，例如15μmol/m²/s、20μmol/m²/s、30μmol/m²/s、40μmol/m²/s、50μmol/m²/s、100μmol/m²/s、150μmol/m²/s、200μmol/m²/s、250μmol/m²/s、300μmol/m²/s、350μmol/m²/s、400μmol/m²/s、450μmol/m²/s、500μmol/m²/s、550μmol/m²/s或580μmol/m²/s，优选15-300μmol/m²/s，最优选50-200μmol/m²/s。本发明的微藻培养方法中，微藻固定化培养时通入含二氧化碳的气体。其中，所述气体中二氧化碳的体积百分比可以是0.1-15%，例如0.2%、0.5%、0.8%、1%、1.2%、1.5%、2%、3%、4%、5%、8%、10%、12%或14%，优选0.1-5%，最优选0.1-2%。本发明的微藻培养方法中，微藻培养的温度可以是15-50℃，例如15℃、17℃、19℃、21℃、23℃、25℃、27℃、29℃、31℃、33℃、34℃、35℃、38℃、40℃、42℃、45℃、48℃或49℃，优选20-40℃，最优选25-30℃。本发明的微藻培养方法中，微藻固定化培养的时间可以是2-10天，例如2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天，优选3-7天。本发明的微藻培养方法中，所述液体培养所用的液体可以是各种类型、浓度或成分的微藻培养基，含一种或多种微藻的藻液，水，含促进因子的溶液，含胁迫诱导因子的溶液中的一种或几种。其中，所述促进因子如培养基中添加的促进生长的生长激素、有机碳源，胁迫诱导因子如培养基中添加的高浓度的NaCl等。本发明的微藻培养方法中，所述微藻包括但不限于蓝藻门、绿藻门、黄藻门、异鞭藻门和红藻门的微藻。其中，所述蓝藻门包括但不限于单细胞藻类和多细胞藻类，例如多细胞的丝状蓝藻（Filamentousxa0Cyanobacteria）、耐高温的温泉蓝藻如席藻（Phormidium）；所述绿藻门包括但不限于小球藻（Chlorella）、杜氏藻（Dunaliella）、栅藻（Scenedesmus）、雨生红球藻（Haematococcusxa0pluvialis）、绿球藻（Chlorococcum）、盘星藻（Pediastrum）和布朗葡萄藻（Botryococcusxa0braunii），优选栅藻、雨生红球藻和布朗葡萄藻；所述异鞭藻门包括但不限于拟微绿球藻（Nannochloropsis）、三角褐指藻（Phaeodactylumxa0tricornutum）、舟形藻（Navicula）和角毛藻（Chaetoceros）；所述红藻门包括但不限于紫球藻（Porphyridium）和耐高温的温泉红藻（Galdieriaxa0sulphuraria）。本发明的微藻培养方法中，将固定化培养的微藻接种到液体的初始接种密度可以是0.5-20g/L，例如0.6g/L、0.8g/L、1.2g/L、1.5g/L、2g/L、4g/L、5g/L、7g/L、9g/L、11g/L、13g/L、14g/L、15g/L、16g/L、18g/L或19g/L，优选1-5g/L，更优选1-2g/L。本发明的微藻培养方法中，所述液体培养时培养物表面的光照强度可以是100-2500μmol/m²/s，例如150μmol/m²/s、250μmol/m²/s、350μmol/m²/s、500μmol/m²/s、700μmol/m²/s、900μmol/m²/s、1100μmol/m²/s、1200μmol/m²/s、1400μmol/m²/s、1500μmol/m²/s、1700μmol/m²/s、1900μmol/m²/s、2100μmol/m²/s、2300μmol/m²/s、2400μmol/m²/s或2500μmol/m²/s。本发明的微藻培养方法中，可以在所述液体培养时调整光照强度、温度、液体成分和浓度、二氧化碳的浓度和pH值各项参数中的一项或多项进行诱导培养产生次生代谢物。其中，所述次生代谢物包括但不限于色素、脂类、烃类和糖类中的一种或多种，色素包括但不限于虾青素和/或类胡萝卜素；所述诱导培养的时间可以是2-10天，例如2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天或10天，优选3-4天。本发明的微藻培养方法中，所述培养可以在封闭、不完全封闭或开放式的环境进行。其中，封闭的环境比如玻璃反应器或聚氯乙烯（Polyvinylxa0chloridexa0polymer，PVC）等透明材质的反应器等，不完全封闭的环境比如通风的玻璃大棚等，开放式的环境比如跑道池等。采用本发明的微藻培养方法，在液体培养阶段，结合传统液体养殖的优点，根据光强和温度调整藻细胞浓度并结合缺氮和/或磷、添加盐和/或有机碳源等胁迫条件，高效诱导次生代谢物的合成，诱导次生代谢物的操作容易实现、诱导效率大幅提高。本发明的有益效果为：本发明的微藻培养方法，将微藻固定化培养和液体培养相结合，在微藻细胞增殖阶段采用固定化培养技术，相比传统的液体养殖，能耗低、藻细胞生长快、不易污染、光利用效率高，不需要严苛的条件就能产生高密度的藻细胞；在微藻次生代谢物诱导阶段，采用液体培养能够高效诱导次生代谢物的合成。
附图说明
图1为本发明实施例1固定化培养的雨生红球藻随培养时间增长藻细胞生物量的变化曲线。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，以下实施例仅为本发明的优选实施例，以便于更好地理解本发明，因而不应视为限定本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂厂商购买得到的。实施例1：雨生红球藻的培养将雨生红球藻（Haematococcusxa0pluvialis）藻细胞置于无纺布上，利用真空泵去除水分，藻细胞截留在无纺布上；将无纺布放置在可封闭培养的0.3m*0.3m*0.04m的玻璃反应器底部内，整个反应器倾斜度为5%（与水平面呈4.5°夹角）放置，反应器顶端有一塑料补水管，为培养液入口，可使培养液持续润湿整个培养体系，反应器另一段底部有一培养液出口，反应器内通入一定量的含0.5%(V/V)CO₂的压缩气体。采用人工顶面照光的荧光灯，光照强度为250μmol/m²/s，24h持续光照；温度为25℃左右，初始接种浓度在10g/m²，培养基为BG11培养基。如图1所示，在固定化培养下，藻细胞的细胞增殖阶段生物量积累能力强，培养6天，藻细胞的生物量几乎呈线性增长，在第6天时达到62g/m²。将上述固定化培养的藻细胞，在上述同样的培养条件下，接种在液体的BG11培养基中，采用内径3cm、高60cm的柱式反应，初始接种浓度控制为2g/L，培养4天生物量达到6g/L。利用两步法培养雨生红球藻10天，生物量（以干重计算）从0.9g生长到15g，产量达到17.6g/m²/d。实施例2：利用雨生红球藻生产虾青素将雨生红球藻（Haematococcusxa0pluvialis）藻细胞置于醋酸纤维膜上，利用真空泵去除水分，藻细胞截留在膜上；将膜取下，放置于事先用培养基润湿的无纺布上，无纺布放置在可封闭培养的0.3m*0.3m*0.04m的玻璃反应器底部内，整个反应器倾斜度为5%（与水平面呈4.5°夹角）放置，反应器顶端有一塑料补水管，为培养液入口，可使培养液持续润湿整个培养体系，反应器另一段底部有一培养液出口，反应器内通入一定量的含0.2%(V/V)CO₂的压缩气体。采用人工顶面照光的荧光灯，光照为200μmol/m²/s，24h持续光照；温度为25℃左右，初始接种浓度为10g/m²，前3天培养基为BG11培养基，后3天改为缺氮的BG11培养基。结果显示，固定化培养6天，每日平均干重产量为9.1g/m²/d，光转化效率（计算公式：PE=E1*100%/E，其中E1和E分别是生物量和光量子的能量，1mol光量子含217kJ能量，1g微藻生物量含21.7kJ能量）为5.3%，比同样光强下内径为4cm的柱式反应器的光转化效率（光转化效率为3.46%）提高53%，虾青素含量为干重的1.5%。后将固定化藻种用少量的离子水冲洗在3cm内径的柱式反应器中，加入缺氮的BG11液体培养基继续诱导，初始接种密度控制在1g/L，350μmol/m²/s的持续24h光强下，液体诱导3天，其虾青素含量为干重的4%（采用Boussiba，1992测定方法），采用两步联用的培养方式，雨生红球藻培养9天虾青素含量达到4%。实施例3：栅藻的培养将栅藻（Scenedesmus）藻细胞置于醋酸纤维膜上，利用真空泵去除水分，藻细胞截留在膜上；将膜取下，放置于事先用培养基润湿的粗布上，该粗布放置在可封闭培养的0.3m*0.3m*0.04m的玻璃反应器底部内，整个反应器倾斜度为5%（与水平面呈4.5°夹角）放置，反应器顶端有一塑料补水管，为培养液入口，可使培养液持续润湿整个培养体系，反应器另一段底部有一培养液出口，反应器内通入一定量的含1%(V/V)CO₂的压缩气体。采用人工顶面照光的荧光灯，光照为250μmol/m²/s，24h持续光照；温度为25℃左右，初始接种浓度为10g/m²，培养基为BG11培养基。结果显示，固定化培养6天，每日平均干重产量为78g/m²，光转化效率为6.0%，比同样光强下内径为4cm的柱式反应器的光转化效率（光转化效率为4%）提高50%，油脂含量为干重的12%。培养6天后将藻种用少量的离子水冲洗在5cm内径、高60cm的柱式反应器中，加入液体BG11培养基，初始接种密度控制在0.8g/L，250μmol/m²/s的持续24h光强下，培养4天，利用两步法培养栅藻10天，产量达到38g/m²/d，油脂含量为干重的20%（采用Inna，2005测定方法）。实施例4：布朗葡萄藻的培养利用长宽高为1.5m*0.5m*0.05m的PVC反应器，反应器内平铺吸水材料（如海绵），海绵上铺一层350目的筛绢，将布朗葡萄藻（Botryococcusxa0braunii）均匀喷洒在筛绢上，接种密度为12g/m²。在室外条件下，按7%（与水平面呈6.3°夹角）的倾斜度放置于长宽高为1.5m*0.5m*2m的金属支架上，反应器顶端有一塑料补液管，可使培养液持续润湿整个培养体系，反应器另一段底部有一培养液出口，向补液的罐内通入一定量的含0.8%(V/V)CO₂的压缩气体，通过遮阳板将照射在藻种的光强控制在300μmol/m²/s左右，温度为20-30℃，培养基为BG11培养基。连续固定化培养7天，生物量达到49g/m²。收获培养的细胞，将其放置在50×50×5cm的板式反应器，采用BG11培养基，初始藻种接种密度为1.5g/L，此时太阳每天平均光强约为400μmol/m²/s，继续进行培养，培养4天。利用两步法培养葡萄藻10天，产量达到11g/m²/d。总烃含量达到干重的20%（采用Inna，2005测定方法）。实施例5：丝状蓝藻的培养利用长宽为1m×1m的普通玻璃片，两面贴普通滤纸，作为补培养液的层，后在滤纸上贴一层打印纸，将丝状蓝藻（Filamentousxa0Cyanobacteria）均匀涂布于打印纸上，接种密度约为10g/m²。在室外条件下，将上述涂有藻体的玻璃片放置透明容器内，共10片，每片间隔10cm，每片玻璃片顶端有一均匀打孔的塑料补液管，可使持续润湿整个培养体系，玻璃片底部有收集培养液的容器，容器内放有液体循环泵，通入一定量的含0.5%(V/V)CO₂的压缩气体，每片的光强控制在50-400μmol/m²/s之间，温度为25-35℃，培养基为BG11培养基。连续固定化培养7天，每日生物量产量约为80g/m²/d。收获培养的细胞，将其放置在液面深度为0.05m的户外跑道池，采用BG11培养基，初始接种密度为2.5g/L，此时太阳每天平均光强为450μmol/m²/s，液体培养3天，利用两步法培养丝状蓝藻10天，产量达到90g/m²/d。实施例6：小球藻生产脂类在通风较好的玻璃大棚内，利用10m*1m跑道池，接种小球藻（Chlorellaxa0sp.）藻种，接种液位为10cm，初始浓度为0.5g/L，将附着小球藻较好的棉布条（长宽为：1m*0.8m），垂直悬挂于跑道池内，不断补充跑道池内的藻液润湿布条，布条的一端有5cm左右浸没在跑道池藻液中，布条间隔0.2m。其中，跑道池圆弧形一头空留，放置一搅拌桨。跑道池底部设有补气管，内通入含1.5%(V/V)CO₂压缩气体，此时太阳每天平均光强为550μmol/m²/s，，温度为15-25℃，培养基为BG11培养基。养殖7天，布条上每日生物量产量约为15g/m²/d，液体生物量产量为3.1g/m²/d，跑道池培养7天的总产量为18.1g/m²/d油脂含量达到干重的15%（采用Inna，2005测定方法）。申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细特征以及详细方法，但本发明并不局限于上述详细特征以及详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细特征以及详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明选用组分的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。